轮状病毒检测试剂盒专利，轮状病毒抗原检测试剂注册技术

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轮状病毒检测试剂盒专利，新型冠状病毒检测试剂盒原理及相关专利申请现状分析 ？

冠状病毒病（Coronavirus disease 2019，COVID-19），是一种由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型引发的传染病，目前世界各国对该病致死率（CFR）的估计值差异甚大，截止2021年2月8日，多数国家该病的观测致死率在0.5%~5.0%之间，全球初步修正病死率约为2.9% [1]。

随着新型冠状病毒（以下也简称新冠）疫情的出现，全世界各国都积极与病毒展开斗争。

在疫情防控斗争中，精准、快速地检测病毒是阻隔疫情扩散的重要手段之一。

我国体外诊断企业组织精干力量进行科研攻关，加上药监部门专设绿色审批通道，一大批新型冠状病毒检测试剂盒成功上市，为抗击疫情做出了突出贡献。

截至目前，通过药监局注册上市的新型冠状病毒检测试剂盒达到72个（以注册证编号计）[2]。

接下来本文将介绍不同原理的新型冠状病毒的检测试剂盒以及与新型冠状病毒检测试剂盒相关的专利申请现状。

检测试剂盒的分类与原理 表1：

各类型新型冠状病毒检测试剂盒特点[3] 核酸检测试剂盒 目前，我国批准上市的核酸检测试剂盒共36个[2]，核酸检测方法主要包括PCR法、恒温扩增法、测序法、CRISPR检测法等，目前还研发出基因芯片技术。

第二代PCR技术（荧光PCR）是病毒检测方法的主流方法，也是目前我国批准上市的核酸检测试剂盒采用最多的技术。


DNA聚合酶链式反应（PCR原理）[4] 抗体检测试剂盒 抗体法基本原理是抗原抗体结合，目前我国已经有4个抗体检测试剂盒上市[2]，包括上转发光免疫层析法、磁微粒化学发光法和胶体金法。

其中，胶体金法由于使用方便且可用肉眼直接观察结果，是本次新冠抗体法检测试剂盒采用的主要技术。


胶体金法与磁微粒化学发光法对比[5] 图3：

免疫应答一般规律[5] 病毒感染人体后，身体的免疫系统会自动反应，产生相应的特异性抗体（IgM、IgG）抵抗病毒。

理论上，IgM抗体产生略早。

但消失也快；IgG抗体在IgM抗体产生后出现，但维持时间更长。

若是采样时间过早，抗体还未产生或者产生量少，便会造成所谓的“漏检”，因此，建议检测新冠抗体时，对IgM抗体和IgG抗体进行联合检测[5]。

抗原检测试剂盒 2022年3月10日，国家卫健委组织制定并发布了《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》，在核酸检测基础上增加抗原检测作为补充，最大的好处是能实现受检人群的快速自测。

目前，我国已经有32个抗原检测试剂盒上市[2]，采用技术主要为荧光免疫层析法、乳胶法和胶体金法等。

抗原检测所需时间短，可用于疑似病例的快速筛查。

但抗原检测灵敏度低，不能单独用于新型冠状病毒感染的诊断，应结合核酸检测、影像检测以及病史、接触史判断感染状态。

检测试剂盒的专利申请现状 截止2022年6月10日，利用Incopat数据通过关键词检索发现，与新冠相关的试剂盒的中国专利数量申请号合并后共计1437件（包括仅提及试剂盒，主要是蛋白及其序列、制备方法的改进相关申请）。

轮状病毒检测试剂盒专利，轮状病毒六种检测技术分析

 一、轮状病毒 (rotavirus，RV）是引起婴幼儿及各种幼龄动物非细菌型腹泻的主要病原体 ， 由澳大利亚科学家 Bishop 于1973 年首次在严重腹泻的婴儿胃肠道内发现。

该病毒由于外观酷似车轮而得名。

轮状病毒属于呼肠孤病毒科，成熟的病毒颗粒直径约为 70-75nm，由 3 层二十面体蛋白衣壳组成，最里层的核衣壳中包裹着病毒的基因组——11 个不连续双链 rNa。

根据其内层衣壳蛋白 (viral protein，VP)-6 的组特异性抗原表位，轮状病毒可分为 a~G 等 7 个群，它们通过感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。

其中感染人、牛和猪的是 a、B 和 C 群轮状病毒，a 群轮状病毒是引起婴幼儿重症腹泻的主要原因 ， 是科学工作者研究的重点。

根据 1986-2000 年轮状病毒性腹泻病例统计，全世界每年因轮状病毒感染导致的 5 岁以下低龄儿童腹泻病例约有 1.11 亿，约 2500万例患儿需要寻医就诊，200 万人需要住院治疗，其中死亡人数高达352，000-592，000 人 ( 如图 1)，且病患人数逐年增加。

据调查，在撒哈拉以南的非洲和亚洲地区，超过三分之一的婴幼儿腹泻及胃肠炎疾病是由轮状病毒引起的，每年导致 50 万到 60 万婴幼儿死亡。

欧洲和美国预防和治疗该类疾病的直接和间接的医疗费用高达数 10 亿美元。

在我国，0 ～ 2 岁以内的婴幼儿人数约为 4000 万人（含新生儿），每年大约有 1000 万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4。

因此，能够快速有效地诊断轮状病毒性腹泻是医学界的重要课题。

轮状病毒广泛存在于自然界，耐热，耐酸碱，结构稳定，传染性很强，潜伏期 3 天左右，一般经粪一口途径传播 ( 也可通过呼吸道传播 )，病人和隐性带毒者均可为传染源。

秋季是轮状病毒性腹泻的高发期。

在我国，每年的 10 月至次年的2月均有一个婴幼儿腹泻的发病高峰，病原学研究证实，这些病例的 40%~60% 都是由轮状病毒引起的。

婴幼儿轮状病毒性腹泻病程一般可持续3至9天，感染发病初期表现为流涕、咳嗽、发热、咽部疼痛等感冒症状，每日腹泻次数在数次至数十次不等，且伴有呕吐、腹痛，因此容易被误诊为胃肠型感冒。

因此对轮状病毒感染的正确检出在疾病治疗中显得非常重要。

轮状病毒随带毒者粪便排出体外，通过粪一口途径感染病人后，在患儿的十二指肠粘膜细胞中增殖，引起十二指肠粘膜表面绒毛变短钝，十二指肠表皮细胞内二糖酶减少，从而影响患儿肠道对盐类、糖类和水分的正常吸收，造成腹泻。

有报道指出轮状病毒感染十二指肠上皮细胞后，还能够通过胃肠屏障进入血液，引起轮状病毒血症，造成呼吸系统、中枢神经系统、其他消化器官以及循环系统的损害，导致患儿引起肺炎、中毒性心肌炎等严重并发症，更甚者还可合并脑炎、肺炎、肠出血、肠套叠或病毒性心肌炎而危及生命。

轮状病毒肠道外多器官的感染并发症已成为导致患儿死亡的重要原因之一。

尽管有一些药物可缓解轮状病毒感染引起的临床症状，但目前还没有治疗轮状病毒感染的特效药物。

由于目前的防治措施还不十分有效，因此发展快速、准确、早期的 rV 检测方法，对于防止轮状病毒暴发流行，早期诊断，早期治疗等具有重要意义。


轮状病毒主要的测定方法 轮状病毒的预防监测需要快速准确的诊断技术支持。

用于轮状病毒的检测技术包括直接血凝技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、电镜技术、基因检测技术、酶联免疫技术和胶体金技术等。

1、直接血凝技术 用轮状病毒抗体致敏血球的检测方法，主要从唾液、粪便等分泌物中检测轮状病毒。

该方法的结果不易重复，需要有经验的技术人员。

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 RV基因组由 11 个双链 rNa 片段组成，可以通过提取粪便中病毒rNa，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳形成独特 11 条区带，来判断是否感染轮状病毒。

rNa 电泳图谱，既有诊断价值，又可区别不同型病毒感染，但是 rNa 提取较难成功且操作繁琐耗时。

3、电镜技术 在大便中用电镜直接检出特殊形态的轮状病毒颗粒，敏感性较高，是鉴定轮状病毒的经典方法。

但由于病毒颗粒易于降解常常影响正确诊断，并且电镜设备昂贵，难以普及，故电镜技术的应用大大受到限制，一般只能用于研究。

4、基因检测技术 PCR技术是核酸分子定性和定量检测的最常用方法，为轮状病毒等难培养的病毒的诊断及病毒学研究提供了一个有力的手段。

荧光定量PCR虽然操作复杂、需要专门培训的技术人员、特殊的仪器设备，但其特异性强、灵敏度高、定量准确，在病原学诊断方面具有很高的应用价值。

5、酶联免疫吸附试验技术 酶联免疫吸附检测（ELISA）是目前应用最广泛的免疫检测方法。

操作简便，灵敏度和特异度高，可检测 105 ～ 106 个病毒颗粒／ g 的粪便样本。

1985年被 WHO 推荐作为轮状病毒的标准检测手段。

一般使用的是 ELISA双抗体夹心法，该方法可根据不同检测目的设计特异的包被抗体和标记抗体；不仅用于诊断，还可进行血清分型、毒株鉴别等，适用于大规模临床检测和流行病学调查。

但由于粪便标本成分复杂，如果腹泻标本含较多的油脂和悬浮物，无法离心干净，易形成非特异性凝集物，可能干扰抗原和抗体的特异性结合，从而导致结果判断错误。

6、胶体金技术 该技术是纳米胶体金与免疫学技术结合所产生的快速诊断产品。

该方法以胶体金作为示踪标志物，通过渗滤或层析提高抗原抗体反应的效率，形成的红色胶体金条带肉眼即可辨别，也可用灰度仪测量。

经过 30 多年的发展现在已相当成熟，在 HIV、HCV、HBV、流感病毒等传染病诊断，HCG、LH 等生殖激素检测，毒品和药物依赖鉴定，以及农业、环保等领域都有着广泛应用。

轮状病毒检测试剂盒专利，轮状病毒抗原检测试剂注册技术

 病毒等微生世界在近两年逐渐成为医学诊断行业的热点之一，国家药监局近期配套出台了多个体外诊断试剂注册技术指导原则。

2021年4月15日，总局发布《轮状病毒抗原检测试剂注册技术审查指导原则（2021年第24号）》，详见正文 轮状病毒抗原检测试剂注册技术审查 指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对轮状病毒抗原检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评申报资料提供参考。

本指导原则是对轮状病毒抗原检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需阐述理由及相应的科学依据。

同时应根据产品的具体特性对研究内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他合理方法也可以采用，并应提供详细的研究资料和验证资料。

应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围 轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属。

轮状病毒颗粒为球形，直径70～75nm，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状。

轮状病毒基因组总长约18kb，由11个节段的双股RNA组成，分别编码6个结构蛋白（VP1～4，VP6和VP7）和5-6个非结构蛋白（NSP1～NSP5/6）。

根据内层衣壳蛋白VP6的血清型，目前主要将轮状病毒分为A～G群。

已知A、B、C群轮状病毒可致人类急性胃肠炎，其中A群轮状病毒最为常见，是引起婴幼儿急性肠胃炎的主要病原体之一。

B群轮状病毒可在儿童和成人中暴发流行。

C群轮状病毒的发病率相对较低。

轮状病毒根据VP6蛋白的两个抗原决定簇可分为4个亚群（Ⅰ，Ⅱ，Ⅰ＋Ⅱ，非Ⅰ非Ⅱ）。

根据VP7和VP4表达中和抗原的不同，又可分为多个血清型或基因型。

VP7蛋白是糖基化的蛋白，决定G的血清型。

VP4是蛋白酶敏感蛋白，决定P的血清型/基因型。

目前世界范围内流行的A群轮状病毒主要为G1、G2、G3、G4、G9、G12等血清型，P分型主要为P[4]、P[8]和P[6]等基因型。

我国常见的A群轮状病毒型别主要为G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]、G2P[4]等。

轮状病毒可污染食物、水和环境等，主要通过粪-口途径传播。

轮状病毒感染的典型症状为呕吐、腹痛、腹泻，部分伴发热，严重脱水和/或电解质紊乱者可能会出现休克、昏迷甚至死亡。

本指导原则适用于以抗原抗体反应为原理，对人粪便样本或其他适用样本中的轮状病毒进行体外定性检测的试剂，临床用于急性胃肠炎患者轮状病毒感染的辅助诊断。

对于采用其他检测方法的试剂，有利之处可参照执行。

本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。

其他未尽事宜应当符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）（以下简称《办法》）等相关法规要求。

二、注册申报资料要求

（一）综述资料 主要包括临床适应症背景情况、产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他内容。

其中，产品描述应明确试剂盒可检测的轮状病毒具体群组；其他内容包括同类产品在国内外批准上市的情况，应着重从检验方法及临床适用范围等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。

综述资料应符合《办法》和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（原国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号，以下简称《公告》）的相关要求。

（二）主要原材料的研究资料 主要原材料包括抗原、抗体、质控品、参考品等。

应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量标准等相关研究资料。

如主要原材料为企业自制，应提供其详细制备过程；如主要原材料源于外购，应提供资料包括：

选择该原材料的依据及对比筛选试验资料、供应商提供的质量标准、出厂检验报告，以及该原材料到货后的质量检验资料，供应商应固定，不得随意更换。

申请人应对各主要原材料均明确质量控制标准。

1。特异性抗原、抗体 病原体特异的抗原、抗体是该类产品的关键原材料。

对于抗原，如为天然抗原应明确来源，如为重组抗原应明确相应的核酸或者蛋白序列信息。

应详述抗体所针对的抗原表位和抗体制备所用的免疫原，提交确定该抗体作为主要原材料的依据，还应提交抗体来源、制备、筛选、鉴定及质量标准（外观、蛋白浓度、纯度、分子量、效价、功能性试验等）等详细试验资料。

2。其他主要原材料 除上述主要原材料外，产品中包含的其他主要原材料，如其他抗体、胶体金、硝酸纤维素膜、微孔板、样本稀释液等，均应进行选择及验证，并提交相关资料。

明确主要原材料的供应商和质量控制标准。

3。试剂盒质控品/质控线 产品应设置合理的质控品/质控线。

质控品（如适用）应至少包含阴性和阳性两个水平。

阳性质控品可选择灭活的病毒株或临床阳性样本，阴性质控品可选择临床阴性样本等。

提交质控品/质控线相关原料的来源、选择和性能确认等相关研究资料，明确供应商和质量控制标准。

企业应对质控品/质控线的检测结果做出明确的范围要求（试验有效性的判断）。

4。企业参考品 应提交企业参考品的原料来源、选择、制备、阴阳性及浓度/滴度确认方法或试剂等相关验证资料。

企业参考品的基质应与实际样本相同。

阳性参考品应至少包括所有常见型别的病毒株或临床阳性样本，并设置不同滴度水平。

A组轮状病毒型别应至少包括G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]和G2P[4]等。

阴性参考品应考虑检测特异性的评价，应纳入正常临床样本、含干扰因素的样本及其他病原体特异性抗原阳性样本。

检测限参考品可设置病毒株/临床阳性样本的系列梯度样本，其中应包含检测限附近水平。

A组轮状病毒型别应至少包括G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]和G2P[4]等。

精密度参考品一般包括弱阳性水平、中/强阳性水平。

（二）主要生产工艺及反应体系的研究资料

1。产品基本反应原理介绍。

2。主要生产工艺介绍，可用流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。

3。包被/标记工艺研究，申请人应考虑如包被/标记液量、浓度、时间、条件等指标对产品性能的影响，通过实验确定上述指标的最佳组合。

4。显色系统、酶作用底物等的介绍以及最适条件研究。

5。反应条件确定：

申请人应考虑反应时间、判读时间、反应温度、洗涤液体积和洗涤次数（如涉及）等条件对产品性能的影响，通过实验确定上述条件的最佳组合。

6。反应体系中样品加样方式及加样量确定：

通过实验确定最佳的加样方式及加样量。

如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测，申请人还应对样本稀释液及其用量、其他必要的处理方法等进行研究。

（三）分析性能评估

申请人应提交对试剂盒的全部性能进行评估的资料，对于每项分析性能的评价都应包括研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。

有关分析性能评估的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、人员及数量、适用仪器、仪器扫描模式、试剂规格、批号、临床样本来源（如涉及）等。

分析性能评估的实验方法可以参考相关文件或指导原则进行。

建议着重对以下适用分析性能进行研究：

1。样本采集和处理 研究对保存液成分、浓度和使用量的要求；具体采样量和采样方式的要求；样本运输和保存要求等。

2。最低检测限 2.1最低检测限的确定 在进行最低检测限研究时，应先进行检测限范围的初步确认。

最低检测限的确定试验建议采用梯度稀释的病毒、每个梯度的病毒液重复3-5份、每份重复检测不少于20次，通常将具有90%-95%以上阳性检出率的病毒水平作为最低检测限。

建议采用蚀斑形成单位（plaque forming units，PFU）或半数组织培养感染量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）法进行病毒滴度的滴定，并采用上述两种方式作为病毒浓度的表示方式。

2.2最低检测限的验证 应在最低检测限水平附近，选择不同来源的病毒株进行最低检测限的验证。

最低检测限的验证应包含轮状病毒所有常见型别（至少包括G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]、G2P[4]等，以及近年来我国流行的型别）。

试验采用的稀释液应与适用样本类型的性质一致。

应提供详细的病毒滴度的确定方法，同时应详细描述病毒样本的确认方法及验证结果。

3。包容性 申请人应使用轮状病毒所有常见型别的多个病毒株，进行包容性的验证，以考察试剂对不同病毒株的检出能力。

可从最低检出限、重复性、准确性等方面进行验证，提供样本相关信息及病毒浓度的确认方法、实验数据。

4。精密度 应对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，包括检测时间、分析仪、操作者、地点、检测轮次等要素。

设定合理的精密度评价周期，对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

用于精密度评价的临床样本应至少包含3个水平：

阴性样本、临界阳性样本、（中或强）阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求。

5。特异性 5.1交叉反应 用于交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性：

抗原结构的同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位可能存在的其他微生物。

建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。

申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。




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